熒光顯微鏡的一個重要特點是它能夠探測到熒光的對象，有時隱隱可見，甚至非常明亮與黑暗的背景（通常是黑色）。為了優(yōu)化此功能，使用的引物在該部分將要討論的原則，圖像的亮度和分辨率必須最大化。

圖像亮度 - 優(yōu)化的圖像的亮度的最重要的方面之一是，以確保在每個連接到試樣的發(fā)色基團的適當?shù)牟ㄩL，樣品被提供用于激勵具有足夠的光能量。同樣重要的是，選擇適當?shù)?/span>擋板濾光鏡，向觀察管或攝像管發(fā)射的熒光的量最大化。我們已經(jīng)組建了一個表列出的熒光激發(fā)和發(fā)射數(shù)據(jù)，這將有助于實現(xiàn)這一物鏡。高能量的光源，如汞和氙氣的燃燒器，將提供大量的激發(fā)能在非常窄的范圍的近紫外和可見光。當使用這些光源耦合到同時阻擋那些是不希望的，能夠發(fā)送所選波長的激發(fā)濾光鏡，適當?shù)剡x擇，然后將滿足用于激發(fā)的最佳標準。

擋板濾光鏡，防止不需要的波長進入觀察管的選擇是一個主要問題。激發(fā)的總能量是遠遠大于發(fā)射的能量，因此，重要的是要選擇一個有效的擋板濾光鏡，將阻止不必要的波長熒光發(fā)射，同時允許從樣品通過。為熒光選擇的物鏡必須能夠有效地透射光，在近紫外區(qū)域和在整個可見光譜。

在低發(fā)射的光水平的圖，在熒光顯微鏡中的作用的物鏡是非常重要的，因為它是收集來自樣本的光的物鏡的功能。物鏡所接受的光的錐角是由數(shù)值孔徑（NA）為物鏡來確定，如在圖1中示出。在透射光中的熒光顯微鏡，到達眼睛或其它檢測器的光的強度成正比作為物鏡和聚光鏡的總放大倍數(shù)的平方成反比的數(shù)值孔徑的平方。

另一方面，在反射光熒光的圖像的強度變化直接作為使用中的數(shù)值孔徑的四次冪物鏡，以及數(shù)值的總放大倍數(shù)的平方成反比：

I = NA4 / Mag2 

這種差異來作為物鏡的最初功能作為一個聚光鏡，用于在樣本上的光聚光，然后作為用于圖像形成的通常的光采集的結(jié)果。其意義是顯而易見的：高數(shù)值孔徑物鏡會產(chǎn)生高得多的強度比相同的放大倍數(shù)較低的數(shù)值孔徑的物鏡圖像。例如，其他的事情都是平等的，40倍物鏡的NA為1.0將帶來超過5倍的亮度比40倍物鏡的數(shù)值孔徑為0.65的圖像。進一步的含義是，如果可能的話，低倍率的視覺目鏡（如8倍的放大倍率）也將增加圖像的亮度相比，比較常用的10X觀察目鏡。此外，在反射光中的熒光，激發(fā)光被濃縮的物鏡（在其作為聚光鏡的功能），僅在被觀察的區(qū)域。其結(jié)果的激勵光的強度遠高于在透射光中的暗視野熒光，其中被激發(fā)的面積不改變作為物鏡被改變。此外，在暗視野，物鏡的數(shù)值孔徑必須被減小到低于保存的視場的黑暗的聚光鏡。

除了是一個重要的考慮因素的數(shù)值孔徑，這是可取的有最高質(zhì)量的色差校正的物鏡，因為聚焦在同一平面上的各種顏色，將產(chǎn)生更清晰的圖像。另外，更好的球面校正，更清晰的圖像。因此中，物鏡的選擇是平場復(fù)消色差物鏡或平場熒光物鏡。的設(shè)計應(yīng)使這些透鏡元件及其水泥本身不會自動熒光時，低于400納米的波長（光在近紫外）光照射。

在可能的情況下，應(yīng)采用油浸物鏡，從載玻片和蓋玻片表面反射所造成的光損失減少到最小。現(xiàn)代顯微鏡制造商努力為客戶提供光學(xué)元件是完全免費的自體熒光污染物，但是這方面也應(yīng)考慮自體熒光將減少通過增加背景亮度對比樣品。

圖像分辨率 - 皇家顯微學(xué)會（RMS）標準蓋玻片厚度如果0.17毫米。中的統(tǒng)計抽樣，由于在制造過程中的波動的蓋玻片這個號碼（通常0.01毫米0.03毫米）的有一種輕微的變化程度。高數(shù)值孔徑“干”的物鏡是最容易受到這些變化，許多人提供校正衣領(lǐng)，讓顯微鏡微調(diào)物鏡校正玻璃蓋厚度。這是非常重要的，購買高度精確的蓋玻片，確保物鏡校正衣領(lǐng)優(yōu)化調(diào)整。此外，一些廠商提供專業(yè)化的物鏡，包含一個內(nèi)部的虹膜式光圈與100X復(fù)消色差透鏡奧林巴斯物鏡如圖2所示。應(yīng)盡量減少眩光的這個可變光闌（圖2）進行適當?shù)恼{(diào)整，如果配備的話，在使用的物鏡。

當使用油浸物鏡，吸干鏡頭前用紙巾除去油使用后，確保清潔定期用適當?shù)娜軇ㄍǔ＜s一個月一次就足夠了）。多余的油留在浸泡物鏡可以拿起空氣中的灰塵，并降低圖像質(zhì)量和分辨率。此外，還要確保浸油，無PCB，有一個非常低的或不存在的電平的自體熒光，被施加到?jīng)]有形成氣泡的物鏡蓋玻片界面。

顯微鏡的光路中應(yīng)仔細調(diào)整，以確保所有組件都已正確放置并執(zhí)行，它們被設(shè)計。應(yīng)正確對準光源的電弧光源為我們的討論中所描述的熒光顯微鏡。

清潔光學(xué)元件 - 在熒光顯微鏡（和所有其他形式的顯微鏡）的第一條規(guī)則是要保持完全免費的灰塵，污垢，油，溶劑和任何其他污染物的光學(xué)元件。顯微鏡時，應(yīng)保持在低振動無煙房，是盡可能干凈，并具有循環(huán)空氣的干擾最小。使用防塵蓋顯微鏡在不使用時，保持在氣密容器內(nèi)的所有配件。避免使用腐蝕性溶劑來清潔顯微鏡的任何部分，并且只能使用稀釋過的肥皂水清洗非光學(xué)表面。物鏡應(yīng)保持清潔使用下面的提示：

?切勿拖動任何具有高度的壓力，包括鏡頭紙在鏡頭表面，以避免表面上的可能性非常細微的劃痕引入。
?用溶劑設(shè)計的光學(xué)表面，或在緊急情況下，無水乙醇清潔鏡頭。避免其他溶劑，因為它們可能與光學(xué)鍍膜玻璃上反應(yīng)。
?灰塵在鏡頭表面前壓縮氣體用溶劑清洗，以去除松散顆粒。
?浸泡棉條鏡頭清潔劑或酒精輕輕擦拭它在鏡頭轉(zhuǎn)動棉簽頭幾次，每次傳球前。用鏡頭紙吸干多余的溶劑，并讓鏡頭徹底晾干。重復(fù)此過程。

油浸鏡頭可以用溶劑清洗，如上面所述。切勿使用油與物鏡擬用于干燥，因為清潔干燥的物鏡困難得多一個專為油。

進一步提示和故障排除 - 在理想情況下，所有應(yīng)做顯微鏡在黑暗的房間，但熒光顯微鏡，這一點尤其重要。人類的眼睛有問題，迅速調(diào)整到天黑，這將是很難辨別一個非常暗淡的熒光標本后立即變黑房間。通過阻斷激發(fā)光時，不觀看或攝影標本，避免過度漂白的標本。盡量減少自體熒光去除多余的熒光在安裝前徹底清洗試樣。對于其他方面的一般問題的解決和故障排除，請參閱下面的表1。

表 1

顯微攝影的熒光標本，提出了一些獨特的挑戰(zhàn)，是無與倫比的光學(xué)顯微鏡。雖然相機系統(tǒng)參數(shù)保持不變，必須支付更多的關(guān)注，暴露的細節(jié)和這些文物互惠故障發(fā)生的結(jié)果非常長的曝光時間。有許多好書的主題，有興趣的讀者被稱為我們的參考書目和網(wǎng)絡(luò)資源的進一步信息部分。